1.1樣本前處理

每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm 離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；棉拭子直接取100μL提取。

1.2RNA提取

推薦采用RNA提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑AIV-H7N9 反應(yīng)液 酶液

用量20μL 1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到PCR反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL；熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM、CY5，淬滅通道（Quencher Dye）選擇NONE，ABI系列儀器請勿選擇ROX參比熒光，選擇None即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1cycle 95℃ 10min 否

3 40cycle 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

FAM通道為禽流感病毒H7N9亞型H7基因檢測結(jié)果，CY5通道為禽流感病毒

H7N9亞型N9基因檢測結(jié)果

陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現(xiàn)明顯擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值≤35.0和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

6.檢測方法的局限性

樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定

量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。